FARMACI TERATOGENI NELL’UOMO
Farmaco (o classe di farmaci)
Anomalie associate più frequenti
ACE inibitori Danno renale, difetti di ossificazione, oligoidramnios, ritardo di crescita intrauterino (III trimestre) Acido valproico Difetti del tubo neurale (1-2% di incidenza) Aminoglicosidi Difetti della funzione uditiva Aminopterina e derivati Difetti cranio-faciali, degli arti e del sistema nervoso centrale Benzodiazepine Sindrome da astinenza neonatale, apnea, ipotonia ipotermia (in seguito ad esposizioni pre-partum) Busulfan Difetti craniofaciali, cardiaci e degli organi interni, ritardo di crescita intrauterino Carbamazepina Difetti del tubo neurale (incidenza <1%) Ciclofosfamide Abortività, labiopalatoschisi, difetti oculari Cumarinici Ipoplasia nasale, condrodisplasia puntata, difetti delle ossa, faciali e del sistema nervoso centrale (fino al 10% di incidenza per esposizioni nel I trimestre) Dietilstilbestrolo Carcinoma a cellule chiare della vagina, adenocarcinoma della cervice Difenilidantoina Dismorfismi faciali, anomalie scheletriche, microcefalia, labiopalatoschisi (5-10% di incidenza) Ergotamina (alte dosi) Difetti del tubo neurale, atresia intestinale FANS Oligoidramnios, chiusura precoce del dotto di Botallo, emorragia, enterocolite necrotizzante (III trimestre) Ormoni ad attività androgenica Virilizzazione dei genitali esterni dei feti di sesso femminile Iodio e Iodio 131 Gozzo, ipotiroidismo. Per la radioterapia rischio abortività, di malformazioni, di ablazione tiroidea fetale, ritardo mentale e leucemie. Litio Difetti cardiaci (incidenza <1%) Metimazolo Difetti della cute dello scalpo (1-5% di incidenza), sindrome comprendente: craniosinostosi, ipospadia, difetti cardiaci, atresia coanale, spina bifida ed atresia esofagea. Misoprostol Agenesia degli arti, difetti del cranio, sindrome di Moebius, abortività Penicillamina Cutis laxa, lassità delle articolazioni, ernia inguinale (incidenza <1%) Retinoidi (isotretinoina ed etretinato) Difetti craniofaciali, cardiaci, degli arti e del sistema nervoso centrale, abortività. Per l’isotretinoina 18% di rischio di malformazioni e 40% di abortività Talidomide Difetti cardiaci, oculari, renali, gastrointestinali, degli arti, sordità (rischio del 20% per esposizioni tra il 34° ed il 50° giorno di gestazione) Trimetadione Anomalie cardiache, ritardo di crescita intrauterino Tab 2: Da ISS (Farmacovigilanza)
Epigenetica e malformazioni oro-cranio-facciali Lucia Migliore e Fabio Coppedè Dipartimento di Scienze dell’Uomo e dell’Ambiente, Università di Pisa
................................Principali vie di trasduzione del segnale coinvolte nella morfogenesi del palato Le citochine sono tipiche molecole segnale usate per la comunicazione tra le cellule di un organismo. La famiglia di citochine TGFb (transforming growth factors b) ha un ruolo importante nello sviluppo craniofacciale. Queste proteine presentano profili di espressione spazio-temporale specifici nella regione orofacciale in via di sviluppo ed i loro livelli di espressione possono essere modulati. Sono proteine coinvolte in molti dei processi biologici che si verificano nei tessuti craniofacciali durante lo sviluppo, tra cui la morfogenesi tissutale, la proliferazione cellulare, il differenziamento cellulare, l’apoptosi, la sintesi della matrice extracellulare. Anche se non sono state ancora identificate tutte le singole citochine di questa famiglia, e la loro funzione nello sviluppo orofacciale non è stata ancora del tutto chiarita, è emerso chiaramente il loro ruolo centrale nell’interazione con altre vie di trasduzione del segnale nella morfogenesi, crescita e differenziamento durante il normale sviluppo della regione palatale. Le proteine morfogenetiche ossee (BMP: bone morphogenetic proteins) sono membri della superfamiglia del TGFb (fattore di crescita trasformante), la cui espressione, come quella delle citochine TGFb, è elevata durante lo sviluppo del tessuto embrio/fetale orofacciale, dove intervengono in una notevole quantità di processi biologici. Per esempio la via di segnalazione che coinvolge BMP è implicata nella migrazione delle cellule della cresta neurale nel primo arco branchiale, nella fusione dei processi mascellari e nasali durante la formazione del labbro superiore, nella formazione del palato secondario, nelle interazioni epitelio-mesenchimali che portano alla formazione del tessuto osseo e cartilagineo orofacciale, nello sviluppo dei denti. La Sonic hedgehog homolog (Shh) è una delle tre proteine della famiglia delle hedgehog dei mammiferi. Agendo come morfogeno, Shh regola l’organogenesi embrionale. Una corretta espressione 37 Parte Prima spazio-temporale di Shh nell’ectoderma facciale embrionale, neuroectoderma ed endoderma faringeo durante lo sviluppo orofacciale è considerata indispensabile per una normale morfogenesi craniofacciale, specialmente per l’estroflessione dell’escrescenza frontonasale. Una diminuita espressione di Shh interferisce con la crescita regolare e con lo sviluppo dei processi frontonasali e mascellari, dando origine a schisi facciale, oloprosencefalia, ciclopia, mentre una overespressione dà luogo ad ipertelorismo. Anche alterazioni dell’espressione di alcuni geni correlati con Shh sono associate con l’impossibilità del prosencefalo embrionale a dividersi nei due emisferi cerebrali, evento che dà luogo ad oloprosencefalia. Le proteine Wnt costituiscono una famiglia di molecole segnale secrete, altamente conservate nel corso dell’evoluzione, che regolano le interazioni cellula-cellula durante lo sviluppo. Queste glicoproteine agiscono come morfogeni durante le prime fasi dell’embriogenesi, nei confronti della proliferazione cellulare, del differenziamento e dell’apoptosi e la perdita della loro funzione nei vertebrati risulta in un ampio spettro di difetti dello sviluppo. Hanno un ruolo chiave nello sviluppo facciale della regione mediana e nella fusione labiale, interagendo con altre vie di trasduzione del segnale (TGFb) e sono importanti mediatori della crescita mesenchimale del primo arco branchiale e del differenziamento epiteliale. Fig. 9a-a Epigenetica In questi ultimi anni numerosi approcci genetici, sia in popolazioni umane sia in modelli animali, hanno dato notevoli contributi all’identificazione dei geni coinvolti nelle labiopalatoschisi. Sono stati ricercati polimorfismi a singolo nucleotide (Single Nucleotide Polymorphisms, SNP), che rappresentano una variazione della sequenza del DNA (sostituzione, inserzione, delezione di una base) (si veda il cap. di Genuardi). Le comuni varianti genetiche presenti negli organismi umani, e la loro localizzazione sul DNA, sono descritte in un catalogo, detto HapMap (http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov). Queste informazioni vengono usate per correlare varianti geniche con il rischio di malattie specifiche e continuano a rivelarsi preziose anche per identificare fattori di rischio per i difetti craniofacciali. Tuttavia è diventato sempre più evidente che il genoma è anche organizzato su un altro piano completamente differente, ”sopra” la sequenza, cioè a livello epigenetico (dal greco epi= sopra). L’epigenetica è lo studio dei cambiamenti ereditabili del fenotipo o dell’espressione genica attraverso meccanismi diversi dalla sequenza del DNA. Specifici processi epigenetici, soggetti a regolazione, includono l’interazione tra due alleli di un singolo locus, la trasmissione della memoria cellulare, l’imprinting, l’inattivazione del cromosoma X, il silenziamento genico e, molto importante per il tema che stiamo trattando, il differenziamento cellulare tessuto-specifico. Attualmente è in corso il Progetto Epigenoma Umano (Human Epigenome Project, HEP http://www.epigenome.org). Si avvale di collaborazioni internazionali pubbliche e private con lo scopo di identificare, catalogare ed interpretare i profili di metilazione di tutti i geni nei principali tessuti umani. Alla base delle modificazioni epigenetiche vi sono molteplici meccanismi molecolari, i più attivamente studiati finora sono la metilazione, le modificazioni della cromatina e l’azione dei miRNA. La metilazione del DNA La metilazione del DNA è una delle più comuni modificazioni epigenetiche che regolano l’espressione genica nelle cellule di mammifero. Consiste nel trasferimento di un gruppo metilico dalla S-adenosil metionina all’atomo di carbonio in posizione 5 dell’anello citosinico, con il risultato della formazione di una nuova base: 5-metilcitosina (si veda la figura 1). In genere la metilazione avviene sulle citosine che fanno parte di una sequenza dinucleotidica simmetrica CpG. Queste sequenze (nel genoma ce ne sono circa 30.000) tendono ad essere concentrate in regioni note come “isole CpG”, caratterizzate da un contenuto in G-C ³ al 55%, e localizzate nelle regioni promotrici dei geni. Queste isole CpG sono un eccellente substrato per gli enzimi DNA metiltransferasi. In effetti, studi di espressione genica (analisi con microarray dei mRNA, eseguite su RNA totale) in tessuto embrionale craniofacciale murino, dimostrano che durante sviluppo embrionale della regione craniofacciale molte metiltransferasi e proteine leganti le isole CpG metilate sono abbondantemente espresse (si veda la tabella 1) Ciò conferma che il tessuto coinvolto nello sviluppo embrionale precoce della regione orofacciale è attivamente implicato nei processi di metilazione del DNA. La metilazione delle citosine delle isole CpG dei promotori dei geni è correlata con il silenziamento dell’attività trascrizionale, mediante l’inibizione di fattori di legame trascrizionale o tramite interazioni tra le metil CpG binding proteins ed i repressori tra- 38 Malattie Rare, Malattie Genetiche e Malformazioni Oro-Cranio-Facciali scrizionali. I profili di metilazione del DNA durante l’embriogenesi non sono casuali, e contribuiscono all’espressione genica tessuto-specifica. In effetti circa il 50% delle isole CpG è presente in geni tessutospecifici. E il pattern di metilazione delle isole CpG è unico in ciascun tessuto o tipo cellulare. L’impossibilità di stabilire profili di metilazione corretti può portare a letalità embrionale o può risultare in malformazioni dello sviluppo craniofacciale, inclusa la schisi del palato. Nell’eziologia delle malformazioni orofacciali sono stati implicati diversi fattori ambientali, come l’abuso di alcol, il fumo di sigaretta, l’uso di farmaci (acido retinoico) o l’esposizione a determinati composti chimici quali pesticidi, come pure un’alterata assunzione di nutrienti (elementi in traccia o folati). Tutti questi insulti ambientali possono causare una metilazione del DNA aberrante in geni suscettibili durante lo sviluppo embrionale o fetale. Occorre sottolineare che queste alterazioni non possono essere rivelate dalle convenzionali tecniche di screening, come analisi di mutazioni (o il sequenziamento del DNA) o analisi di associazione Genome-Wide (GWAS) (si veda il cap. di Genuardi). Mentre la predisposizione genetica a difetti craniofacciali continua ad essere ricercata analizzando polimorfismi (RFLP o SNP), delezioni o variazioni del numero di copie (si veda il cap. di Genuardi), oggi possiamo iniziare a pensare ai profili di espressione dei miRNA ed al pattern di metilazione dei promotori come possibili biomarcatori per difetti craniofacciali. Il gene che codifica per il fattore trascrizionale Sox4 può fornire un esempio interessante. Sox4 è ampiamente espresso nell’embrione murino e si ritiene abbia un ruolo chiave nel regolare molteplici aspetti dello sviluppo cellulare delle creste neurali. Inoltre Sox4 è stato recentemente identificato come un forte gene candidato per la labiopalatoschisi non sindromica. L’analisi dell’espressione genica di tessuto embrionale di palato murino ha rivelato una significativa repressione temporanea del gene Sox4. Poiché la metilazione di dinucleotidi CpG localizzati all’interno di sequenze di regolazione a monte dei geni è tipicamente associata con la repressione dell’espressione genica, con conseguente riduzione dei livelli di mRNA, è stato determinato il profilo di metilazione delle sequenze CpG del gene Sox4, analizzando DNA genomico isolato da palato murino nel corso dello sviluppo. In effetti sono state osservate differenze nella metilazione a carico di due ampliconi del promotore del gene Sox4, al dodicesimo giorno di gravidanza. Tali regioni sono definite regioni metilate in modo differente nel gene Sox4 (DMR: differentially metilated regions). Poiché i bersagli molecolari del prodotto del gene Sox4 sono costituiti da una ventina di fattori trascrizionali e di regolatori cellulari critici, inclusi quelli appartenenti alle vie di trasduzione del segnale del TGFb e di Wnt, un’espressione aberrante di questo gene mediante meccanismi epigenetici può avere effetti profondi e deleteri sullo sviluppo di regioni, quali il complesso craniofacciale, che dipendono da queste vie metaboliche per la loro normale ontogenesi. Le modificazioni della cromatina Oltre alla modificazione di specifiche sequenze di basi sul DNA, l’espressione genica può essere influenzata anche dalle modalità con cui è “impacchettato” il materiale genetico. L’unità di ripetizione fondamentale della cromatina è il nucleosoma. Ogni singolo nucleosoma è costituito da 4 paia degli istoni “core” (H2A, H2B, H3 e H4) che si complessano strettamente tra loro assumendo la forma di un disco ripiegato alle estremità, intorno al quale si avvolge un tratto di DNA lungo 146 paia di basi. Tra un nucleosoma ed il successivo si estende un filamento di DNA linker di circa 60 paia di basi, associato ad una singola molecola di istone H1 (si veda la figura 2). Cambiamenti della struttura della cromatina possono influenzare l’espressione genica: i geni sono inattivati (spenti) quando la cromatina è molto condensata ed il suo DNA è inaccessibile (eterocromatina), sono invece espressi (accesi) quando la cromatina è relativamente rilassata e aperta (eucromatina). Gli istoni del core vanno incontro ad una vasta serie di modificazioni post-traduzionali, la maggior parte delle quali sono reversibili, strettamente connesse con i cambiamenti strutturali della cromatina. Queste modificazioni, che coinvolgono solitamente gli amminoacidi che costituiscono l’estremità ammino-terminale delle code istoniche, includono metilazione, fosforilazione, acetilazione, sumoilazione, ubiquitinazione e biotinilazione. Sono modificazioni che conferiscono proprietà funzionali in quanto possono facilitare od ostacolare l’associazione tra la cromatina ed enzimi della riparazione o fattori trascrizionali. Ad esempio l’acetilazione degli istoni neutralizza la carica positiva sugli istoni e distrugge l’interazione elettrostatica tra il DNA e le proteine istoniche; ciò promuove la decondensazione della cromatina, che è stata associata con una variazione dell’espressione genica. Per contro la deacetilazione, a cui consegue la condensazione, sopprime la trascrizione. È stato proposto che lo specifico profilo di modificazioni istoniche formi un “codice istonico”, che servirebbe a caratterizzare le porzioni di genoma che devono essere espresse in un certo momento in un determinato tipo cellulare. È stato ipotizzato che, analogamente ad una mutazione genica, una variazione di una modificazione post-traduzionale di code istoniche a livello di una regione di regolazione di un gene possa silenziare un gene attivo, dando origine ad una perdita di funzione, o attivare un gene silente, portando ad un acquisto di funzione. Tali modificazioni possono anche far aumentare o diminuire i livelli di espressione genica in assenza di condizioni di completo silenziamento o di completa attivazione genica. Gli enzimi che aggiungono o rimuovono le modificazioni istoniche interferiscono con una vasta serie di processi che coinvolgono il DNA, come la trascrizione, la replicazione, la ricombinazione, la riparazione, la condensazione cromosomica, l’organizzazione nucleare. Lo stato di acetilazione delle code istoniche è controllato da due famiglie di enzimi con azione antago- 39 Parte Prima nista: istone-acetiltransferasi (HAT), che trasferiscono un gruppo acetilico dall’acetil-CoA all’amminogruppo epsilon dei residui di lisina degli istoni, ed istone-deacetilasi (HDAC), che catalizzano l’idrolisi di queste acetammidi. Un’interessante conseguenza è che inibitori delle HDAC sono stati proposti come agenti chemioterapici, in quanto in grado di indurre l’espressione di geni soppressori tumorali, laddove questa è repressa.......................
Uno sguardo al futuro
Con la tecnologia dell’array genomico, che fa uso di algoritmi matematici per chiarire i pattern di espressione genica e i profili di metilazione, sono state studiate le vie metaboliche critiche per la morfogenesi, e ne sono derivate informazioni affascinanti sullo sviluppo di una serie di sistemi biologici, incluso lo sviluppo della regione orofacciale. Con questi approcci, e nonostante il fatto che tali analisi siano statistiche e non deterministiche, il numero di geni e proteine che hanno un ruolo nell’ontogenesi orofacciale è in continua espansione. Negli ultimi cinquant’anni sono stati fatti molti progressi sulle conoscenze fondamentali dello sviluppo embrionale nella prospettiva di poter applicare tali conoscenze al fine del possibile controllo nonché riduzione del rischio di malformazioni. I progressi in campo biomedico sono in aumento grazie anche a team di ricerca che fanno uso di approcci interdisciplinari che vengono supportati da database accessibili e potenti e mezzi disponibili in rete. Nonostante ciò molti degli eventi molecolari responsabili della morfogenesi orofacciale continuano a rimanere oscuri. Mentre sono stati compresi molti processi, l’eterogeneità tra i difetti di chiusura orofacciale, come anche la complessità dell’ereditarietà, hanno reso difficile la comprensione delle cause che li sottendono. L’attuale pensiero scientifico biologico riconosce che l’epigenetica rappresenta un processo con contributo fondamentale all’embriogenesi e che l’ambiente può avere un effetto profondo nel plasmare l’epigenoma. La conferma più evidente viene da studi riproduttivi in topi agouti. Questi studi hanno dimostrato in modo inequivocabile che la dieta materna, nel corso della gravidanza, può indurre cambiamenti fenotipici, nell’arco di una singola generazione, non tramite cambiamenti nella sequenza del DNA, ma cambiando il pattern di metilazione del genoma. Mentre la metilazione del DNA è una modificazione epigenetica comune che contribuisce al controllo dell’espressione genica nelle cellule di mammifero, sta acquisendo crescente importanza il concetto di metilazione tessuto/cellula specifico quale mezzo di regolazione della morfogenesi della regione orofacciale. I cambiamenti epigenetici, quali la metilazione, sono reversibili e quindi rappresentano attraenti bersagli terapeutici. In effetti i “farmaci epigenetici” quali gli inibitori delle DNA metiltransferasi e/o istone deacetilasi possono revertire i marcatori epigenetici a livello del DNA o degli istoni, inducendo consistenti alterazioni dell’espressione genica. Questa potenzialità di revertire epigeneticamente la metilazione nucleare e/o acetilazione con conseguente riespressione di geni critici rappresenta un’attraente possibilità futura per esplorarne l’uso clinico nei casi in cui il silenziamento genico indotto epigeneticamente o l’overespressione contribuiscano a esiti anomali dello sviluppo come l’induzione di schisi orofacciali. A questo proposito, poiché geni imprinted sono espressi da parte di uno solo dei due alleli parentali, è significativo che le sindromi di Prader-Willy, Angelman e Beckwith-Wiedemann, come pure la sindrome da immunodeficienza ed instabilità centromerica (ICF), con le relative anomalie facciali, siano tutte il risultato di un’anomala demetilazione dell’allele silenziato dei geni soggetti ad imprinting (diversi, per le specifiche patologie), con conseguente espressione biallelica. L’approfondimento delle nostre conoscenze molecolari sulle cascate del segnale che orchestrano l’ontogenesi orofacciale, ad alcune delle quali si è accennato nel corso del capitolo, ci ha permesso di comprendere a grandi linee i meccanismi fondamentali che governano questi processi nel normale sviluppo orofacciale. Molto ancora rimane da capire circa la loro deregolazione che sicuramente è alla base di molte malformazioni quali le schisi orofacciali. Sicuramente lo studio fine dei meccanismi di regolazione epigenetica ci offrirà nel futuro molti altri elementi chiarificatori.......................
Nessun commento:
Posta un commento