Curcuma : il turmerone induce proliferazione delle cellule staminali neurali in vitro e in vivo.

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(Link)Introduzione: curcumina e ar-turmerone Sono i Principali Composti bioattivi Dell'Erba Curcuma.

 

........................Risultati

Effetti sulla NSC proliferazione in vitro 

Per valutare gli effetti di ar-turmerone sul NSC in coltura primaria, ratto fetale NSC sono state coltivate in presenza di varie concentrazioni di ar-turmerone per 72 ore. Il numero di cellule significativamente aumentata quando le cellule staminali neurali sono stati trattati con 3,125-25 mg / ml ar-turmerone ( p  <0.05), con un incremento massimo di numeri NSC da ~ 80% a 6,25 mg / ml (Figura  1 A; P  <0,01). 

Figura 1

Ar-turmerone aumenta NSC proliferazione  . in vitro  (A)  Ar-turmerone aumentato in modo significativo il numero di NSC fetale di ratto in coltura monostrato primaria (media ± SEM; * P  <0,05, rispetto al controllo), dipendente dalla sua concentrazione; immagini a contrasto di fase rappresentativi sono raffigurati di NSC-trattati senza (A') o con (A'') 6,25 mg / ml ar-turmerone (barra rappresenta 200 micron). (B) Ar-turmerone ha aumentato notevolmente il numero di NSC proliferazione, valutata per BrdU-incorporazione (media ± SEM; ** p  <0,01, rispetto al controllo), dipendente dalla sua concentrazione; immagini rappresentative sono raffigurati di NSC trattato senza (B') o con (B'') 3,125 mg / ml ar-turmerone, macchiato per BrdU-incorporazione (barra rappresenta 200 micron). (C) CSN Trattamento con 6,25 mg / ml ar-turmerone led ad un aumento significativo Ki67 mRNA; livelli di mRNA sono stati normalizzati all'espressione RPL13a endogena e calcolati con il 2 -ΔCt metodo; i dati sono rappresentati come media ± SEM; * p  . <0.05 (D) In alte concentrazioni, ar-turmerone notevolmente diminuito rapporto NSC sopravvissuti entro 24 ore di trattamento, concentrazioni wheres tra 1,56 e 6,25 mg / ml avuto alcun effetto (media ± SEM; * P  <0,05, rispetto con il controllo).       

Con il saggio di BrdU-incorporazione, abbiamo prossimo studiato se questo aumento del numero NSC è stato causato da un aumento della NSC proliferazione. Infatti, il trattamento con determinate concentrazioni di ar-turmerone aumentato significativamente la percentuale di NSCs proliferanti dal ~ 50% al ~ 80% (Figura  1 B; P  <0,01). Questo risultato è stato verificato a livello di mRNA utilizzando qPCR per il marcatore di proliferazione Ki67. In linea con i dati BrdU, il trattamento con 6,25 mg / ml ar-turmerone ha portato ad un aumento significativo Ki67 mRNA (Figura  1 C; P  <0,05).  

Per valutare se ar-turmerone colpite NSC sopravvivenza, cellule vitali e morti sono stati determinati dopo 24 ore, e la proporzione di cellule sopravvissute è stato quantificato per ogni concentrazione di ar-turmerone. Concentrazioni tra 1,56 e 6,25 mg / ml che aveva ceduto il massimo effetto sulla proliferazione NSC non ha influenzato la sopravvivenza cellulare. Concentrazioni più elevate di 12,5 e 25 ug / ml hanno determinato una significativa diminuzione del numero di cellule staminali neurali vitali (Figura  1 D; P  <0,05). 

Potenziale di differenziazione delle cellule staminali neurali

Per valutare l'effetto di ar-turmerone sul potenziale differenziazione delle NSC in vitro , le cellule in fase di espansione sono stati trattati con o senza 6,25 mcg / ml ar-turmerone e permesso di differenziare per 10 giorni dal prelievo di FGF2. Rispetto che nelle cellule di controllo non trattati, il processo di differenziazione era significativamente accelerato in NSC ar-turmerone-trattati, con meno indifferenziate (SOX2-positive cellule) 10 giorni dopo FGF2-ritiro (Figura  2 A; P  <0,01). Inoltre, ar-turmerone trattati con le cellule staminali neurali preferenzialmente differenziato in giovani neuroni, come valutato dal TUJ1 colorazione, rispetto alle cellule di controllo non trattati (Figura  2 A, B, P  <0,01). La generazione di GFAP-positive astrociti e oligodendrociti CNPase-positivi è stata influenzata da ar-turmerone (Figura  2 A, B).   

Figura 2

Ar-turmerone induce neurogenesi  in vitro  e  in vivo.  (A)  NSC potevano differenziare in assenza (controllo) o presenza di 6,25 mg / ml ar-turmerone. Immunocitochimica 10 giorni dopo fattore di crescita interruzione rivelato meno indifferenziate (Sox2 +) NSC nel gruppo turmerone trattato, ma più giovani neuroni. La generazione di astrociti e oligodendrociti non è stata influenzata da ar-turmerone (media ± SEM; ** p  . <0.01, rispetto al controllo) (B) Immagini rappresentative di cellule differenziate sono oligodendrociti CNPase-positivi (a sinistra), TUJ1 positivo giovane neuroni (al centro), e astrociti GFAP-positivo (a destra); . barra rappresenta 50 micron (C) Dopo l'iniezione ICV di 3 mg (1 mg / ml) ar-turmerone, più neuroblasti DCX-positive notevolmente sono stati osservati nel SVZ rispetto agli animali di controllo a iniezione placebo (media ± SEM; ** P  <0.01). (D) colorazione Rappresentante di neuroblasti DCX-positive nel SVZ (barra rappresenta 50 micron).     

Per studiare gli effetti di ar-turmerone sulla neurogenesi in vivo , ratti adulti sono stati iniettati con 3 mg ar-turmerone nel ventricolo laterale del cervello (intracerebroventricolare, ICV). Una settimana dopo il trattamento, il numero di neuroblasti DCX-positive nella zona subventricolare (SVZ) è stato significativamente aumentato rispetto a iniezione placebo animali di controllo (Figura  2 C, D). 

La proliferazione delle cellule staminali neurali endogene in vivo 

L'effetto di ar-turmerone sulle cellule staminali neurali endogene in vivo è stata valutata iniettando ratti adulti con ar-turmerone ICV Per i seguenti 5 giorni, i ratti hanno ricevuto iniezioni sistemiche quotidiane di BrdU per etichettare le cellule proliferanti in vivo . Immunoistochimica 1 settimana dopo il trattamento ar-turmerone rivelato SVZ di ratti trattati per essere più ampia di quella di animali di controllo-iniettato con placebo, come misurato dalla colorazione BrdU (Figura  3 A). Differenze nella dimensione del SVZ, valutata mediante BrdU-colorazione, erano statisticamente significative (Figura  3 B; P  <0,05). BrdU-colorazione dell'ippocampo non ha evidenziato un aumento statisticamente significativo della larghezza della fascia dentata, anche se è stata osservata una tendenza verso una più ampia fascia dentata dopo trattamento con ar-turmerone (Figura  3 C).    

Figura 3

Proliferazione di endogena NSC è indotta da ar-turmerone  in vivo.  (A)  Staining per proliferanti NSC con anti-BrdU dimostra che la zona sottoventricolare (SVZ) di ratti trattati con 3 mg (1 mg / ml) ar-turmerone ICV (sinistra ) è più ampia di quella di animali di controllo trattati con placebo (A', a destra); barra rappresenta 100 micron. (B) Le differenze nella larghezza della SVZ era statisticamente significativa (media ± SEM; * P  <0,05, rispetto ai controlli). (C) BrdU colorazione dell'ippocampo non ha rivelato un aumento statisticamente significativo nel larghezza del giro dentato, anche se è stata notata una tendenza a favore ar-turmerone (media ± SEM).    

Mobilitazione di NSC endogene dalle nicchie neurogenici

Un test non invasivo PET imaging è stato utilizzato per visualizzare e quantificare la mobilitazione di NSC endogene dalle nicchie neurogenici di animali ar-turmerone trattati in vivo . Una settimana dopo l'iniezione ICV di ar-turmerone, il radiofarmaco [ 18 F] FLT è stato iniettato per via sistemica per etichetta proliferanti NSC endogene in vivo , e quindi i dati PET sono stati acquisiti e co-registrato per un 3D atlante del cervello di ratto.  

I cervelli dei ratti ar-turmerone-trattati hanno mostrato notevole accumulo di [ 18 F] FLT nel SVZ ipsi- e controlaterale per l'iniezione ICV (Figura  4 A), rispetto agli animali di controllo Salina a iniezione (Figura  4 B). Inoltre, ratti ar-turmerone-trattati hanno mostrato significativamente più [ 18 F] FLT-accumulo sia nella SVZ e l'ippocampo rispetto agli animali di controllo ( P  <0,01), indicando così una mobilitazione di proliferazione NSCs da entrambi nicchie neurogena (Figura  4 C ).

Figura 4

NSC endogene nelle nicchie neurogene del cervello del ratto sono mobilitati per ar-turmerone  in vivo.  (A)  [ 18 F] FLT-PET di un cervello di ratto 1 settimana dopo l'iniezione intracerebroventricolare di ar-turmerone mostra potenziata accumulo di [ 18 F] FLT nella zona subventricolare rispetto a (B) Saline-iniettato cerebrale di controllo, che indica un aumento di proliferazione NSC endogene causate da ar-turmerone. (C) Ar-turmerone-ratti trattati hanno mostrato significativamente più [ 18 F] accumulo FLT nel SVZ e l'ippocampo che ha animali di controllo (media ± SEM; ** P  <0,01).    

Discussione

I dati suggeriscono che ar-turmerone aumenta l'attività proliferativa delle cellule staminali neurali. Recentemente, gli effetti positivi e negativi sulla proliferazione sono stati attribuiti ad ar-turmerone, dipendente dal tipo cellulare studiato [ 22 ]. Anche se ar-turmerone ha inibito la proliferazione di diverse linee cellulari tumorali, è migliorata la proliferazione delle cellule mononucleari del sangue periferico [ 22 ]. Con la prospettiva di valutare ar-turmerone come candidato farmaco per patologie neurodegenerative o ictus, si deve tenere presente che il potenziamento della proliferazione di NSC, soprattutto da manipolazioni genetiche, porta un certo rischio oncogeno [ 23 ]. Tuttavia, l'espansione farmacologico della nicchia di cellule staminali senza manipolazioni genetiche sembra essere meno associato ad un aumentato rischio di cancro [ 13 , 14 ]. 

Un'altra questione da considerare prima di promuovere l'uso di ar-turmerone negli studi clinici è che siamo qui applicato ar-turmerone in vivo tramite iniezione icv, un percorso che non è ovviamente applicabile in studi clinici. Tuttavia, un altro studio recente ha trovato buona biodisponibilità di ar-turmerone dopo l'iniezione endovenosa o intraperitoneale, sia nel topo [ 24 ].  

In vivo , ar-turmerone ampliato la larghezza della SVZ per ~ 45%. Un'espansione di questa nicchia NSC è stato dimostrato anche per altri agenti farmacologici, quali fattori di crescita [ 13 , 14 ]. In un contesto sperimentale simile, abbiamo precedentemente osservato che FGF2 espansa SVZ da ~ 350%, mentre una combinazione del ligando Notch Delta-like 4 e insulina ha portato ad un aumento della larghezza della SVZ di ~ 66% [ 18 ]. I nostri dati suggeriscono quindi che l'effetto di ar-turmerone sulla nicchia NSC in vivo è di poco inferiore a quella di "classici" pathways NSC-attivazione. Tuttavia, gli effetti pleiotropici di ar-turmerone rendono un promettente farmaco per ulteriori studi.   

Ar-turmerone è stato recentemente descritto per inibire la LPS o l'attivazione Aß indotta della microglia attraverso l'inibizione di NF-kB, JNK-, e le vie p38-MAPK [ 4 , 5 ]. Attivazione microglia come il segno distintivo di una risposta infiammatoria innata del sistema nervoso centrale (SNC) è stato trovato in molti disturbi neurologici che sono considerati essere principalmente nonimmunogenic, come l'ictus [ 25 , 26 ], trauma cranico (TBI [ 27 ] , morbo di Parkinson [ 6 ], o malattia di Alzheimer [ 7 ]. NSC e le cellule immunitarie hanno interagito molto [ 16 , 17 , 28 - 30 ]. Pertanto, terapeuticamente regolano il destino uno dell'ente potrebbe influenzare l'altro.    

Eppure, la nostra conoscenza circa l'interazione di NSC e le risposte infiammatorie nel sistema nervoso centrale in materia di rigenerazione e recupero funzionale ad oggi rimane scarsa. Su attrazione dalle citochine proinfiammatorie, NSC endogene influenzano notevolmente questa risposta rigenerativa [ 31 , 32 ], ad esempio, attraverso inducendo remyelinization [ 33 ] e neuroprotezione [ 15 ]. Come ar-turmerone entrambi i limiti di attivazione della microglia e induce la proliferazione NSC, essa costituisce un futuro candidato promettente farmaco per sostenere la rigenerazione nei disturbi neurologici. 

In presenza di mitogeno in coltura cellulare, così come in condizioni fisiologiche in vivo , abbiamo trovato ar-turmerone promuovere neurogenesi. Tuttavia, dopo l'interruzione FGF2 in vitro , il trattamento con ar-turmerone ha portato ad una riduzione accelerata di indifferenziata NSC, indicando una rapida uscita dal ciclo cellulare. Questo effetto suggerisce che ar-turmerone può agire come antagonista debole al FGF recettore solo in assenza del ligando.  

Ulteriori studi sono necessari per chiarire un tale rapporto putativo. A sostegno di questa nozione, un recente rapporto suggerisce che ar-turmerone agisce come un antagonista sul relativo fattore di crescita epidermico (EGF) recettore [ 34 ].

Non invasiva in vivo imaging è uno strumento fondamentale per la traduzione dal laboratorio al letto del paziente (cioè, da animale sperimentale per studi sull'uomo). Abbiamo usato l'imaging PET e il radiofarmaco [ 18 F] FLT che permette l'imaging e la misurazione della proliferazione, consentendo in tal modo la rilevazione non invasiva e la quantificazione dei endogena NSC mobilitazione nel cervello di ratto adulto in vivo [ 18 ]. Questo test di imaging è in grado di monitorare gli effetti dei farmaci finalizzate ad ampliare l'nicchia NSC [ 35 ]. Usando [ 18 F] FLT-PET, abbiamo trovato qui ar-turmerone per mobilitare NSCs da entrambe le nicchie neurogeni, SVZ e il giro dentato dell'ippocampo, in vivo . Pertanto, questo studio fornisce ulteriori prove per NSC attivazione da parte di ar-turmerone, spaziando dagli accertamenti cellule di coltura che in vivo imaging.       

Conclusioni

In questo studio, abbiamo studiato gli effetti di ar-turmerone sul NSC in vitro e in vivo . Ar-turmerone aumentato il numero di cellule staminali neurali, sia in coltura cellulare e nel cervello di ratto adulto in vivo. Questo aumento il risultato di una maggiore proliferazione NSC e ha portato alla neurogenesi promosso durante la differenziazione. In vivo , ar-turmerone mobilitato le cellule staminali neurali endogene di entrambe le nicchie neurogena, SVZ e l'ippocampo. Proponiamo che ar-turmerone costituisce un futuro candidato promettente farmaco per sostenere la rigenerazione nei disturbi neurologici.      

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma Koeln Fortune / Facoltà di Medicina e Chirurgia, Università di Colonia, in Germania (106/2012), e il progetto del 7 ° PQ dell'UE "NeuroFGL." Ringraziamo la signora Claudia Drapatz e la signora Katrin Eckstein per un'eccellente assistenza tecnica.